技术干货 | 色谱柱延寿实操技巧

样品脏是色谱柱报废的头号元凶。未经过处理的样品中的颗粒、蛋白、油脂、盐分会直接堵塞柱头筛板，不可逆地损坏填料。

1. 强制过滤，没有例外

所有进样样品必须经0.45μm/0.22μm对应滤膜过滤。严禁直接进样未过滤的提取液、发酵液、生物样品或混悬液。

2. 去除蛋白和大分子杂质

生物样品、血清、血浆进样前建议进行蛋白沉淀（yijing沉淀、三lvyisuan沉淀）或固相萃取（SPE）处理。蛋白会与色谱填料产生非特异性吸附，导致柱效快速下降。

3. 高盐样品除盐或稀释

高盐样品，建议进行稀释处理或除盐后再进样，以避免进样过程盐析，导致色谱柱堵塞。

4. 控制样品基质复杂度

对于成分复杂的样品（如中药提取物、土壤提取液、细胞提取液、血清、血浆等），建议先通过固相萃取或液液萃取进行净化，去除大部分杂质后再进样。

相对便宜的保护柱，能有效预防分析柱的堵塞，复杂样品强烈建议配置。

1. 加装在线过滤器

在柱前加装一个在线过滤器，过滤样品中的微小颗粒，能进一步保护色谱柱免受堵塞，过滤器滤芯可拆卸清洗、亦可定期更换，有效降低成本。

2. 加装保护柱

保护柱的填料类型、粒径推荐与分析柱完全一致，或依据实验条件选择。

当柱压明显升高，或观察柱芯明显污染物聚集、或图谱峰形变差，应立即更换保护柱芯。

植物样品、生物样品、复杂辅料样品（如：辅料无法过滤，且会形成胶体）等，均强烈建议加装保护柱，以大幅延长色谱柱寿命。

很多色谱柱的损坏都是日积月累的不当操作造成的，养成良好的操作习惯，能从根本上延长色谱柱寿命。

1. 严格遵守色谱柱的耐受范围

pH范围：普通C18柱为2-8，耐碱柱最高可达12，耐酸柱最低可达1。超出pH范围会导致硅胶基质溶解或键合相水解。

推荐常规C18柱在pH 2-6范围使用，如纯水相中性pH，还需关注长菌问题。

温度范围：不要超过色谱柱标注的最高使用温度，高温会加速键合相流失。梯度结束后先降温再停泵。

2. 正确使用流动相

流动相必须经过过滤后使用，尤其盐相，需过滤颗粒物杂质。

常规非耐水C18柱，应避免使用高比例水相（＞95%）长时间运行，会导致键合相坍缩、塌陷。

切换流动相过程，需提前确认互溶性，不互溶的盐相可能析出，有机相可能形成分层、浑浊，在柱内可能形成乳状液滴，破坏柱填料的均匀性，导致峰形拖尾、柱效下降。

3. 确定与流动相互溶

对于难溶性样品，需尝试以正式运行时，不同时间段流动相进行稀释、静置处理，确定样品无析出，蛋白样品需提前确认无变性沉淀，以防止样品进样与流动相混合后析出导致堵塞。

4. 控制进样量和进样浓度

进样过载同样会污染堵塞色谱柱，一般来说，进样量为色谱柱容量的1%~5%，通常20μl以内。低浓度样品可适当调高进样量，以满足灵敏度需求。

5. 绝对避免流动相走干

流动相走干，空气理论上不会进入色谱柱，但可能因泵的密封圈老化磨损，仍有部分空气进入色谱柱，直接影响图谱。长时间走干，可能导致填料干涸，导致填料聚集、塌陷或产生空隙，使柱效显著降低，甚至直接损坏。建议计算好运行时间，准备足量流动相，亦可开启仪器的低液位报警功能。

即使做好了前面所有步骤，色谱柱还是会逐渐被污染。正确的清洁、再生和保存方法，能让污染的色谱柱“起死回生”。

1. 日常清洁（每次实验结束后必做）

处理顺序：除盐、除目标物、除强吸附杂质，最后保存在合适的溶剂中。

2.深度清洁（柱效下降或压力升高时）

当色谱柱压力明显升高或峰形变差时，进行深度清洁：

反相C18柱常用：以H2O/yijing（95:5或90:10，依据色谱柱耐受程度）开始，逐步提高有机溶剂的含量（75:25 H2O/yijing→50:50 H2O /yijing→100%yijing)。 如无改善，可再用纯异丙醇冲洗。异丙醇较粘稠，建议0.1ml/min流速。 如依旧无改善，还可尝试混合溶液冲洗办法：25%（水+0.1%FA），25%甲醇，25%yijing，25%异丙醇混合后低流速冲洗。   冲洗之后，建议先用80:20 H2O/yijing冲洗，再上流动相。 如柱效降低同时柱压明显升高，在色谱柱支持反冲情况下，建议直接低流速反冲，反冲后继续正用，如有改善，继续正用即可。如效果不理想，可以尝试反接反用，如效果再不好，柱子就报废了。（可最大化利用色谱柱）

3.色谱柱保存

短期保存/长期保存：均参考对应使用说明书。拧紧色谱柱两端的堵头，防止溶剂挥发导致干柱即可。

色谱柱延寿的核心逻辑永远是：预防大于治疗。与其等到柱子堵了、坏了再去想办法再生，不如在日常操作中做好每一个细节。

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