mRNA合成及GMP生产解决方案
mRNA GMP生产工艺流程
一． 质粒构建，扩增以及提取
1. mRNA 模板序列优化及质粒构建服务
GOI/UTR序列优化、定制polyA长度、修饰核苷酸替代
2. 质粒构建产品
Fast Digest限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Phusion Plus高保真DNA聚合酶
 | FastDigest 限制性内切酶是为快速DNA酶切专门研发的高级限制性内切酶。在30多年内切酶的研究中，大量可供选择的同裂酶和卓越的生产能力促使这个包含176种FastDigest限制性内切酶的独特系统的诞生。此外，FastDigest Green 绿色缓冲液兼具上样缓冲液的功能，可直接将反应物上样凝胶电泳，操作更为便利。 |
 | T4 DNA 连接酶催化双螺旋 DNA 或 RNA 中并排的 5-磷酸基和 3-羟基端之间磷酸二酯键的形成。该酶可以修复双螺旋 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂合体中的单链缺口。其还可以将 DNA 片段与黏性末端或平末端结合，但对单链核酸无活性。T4 DNA 连接酶需要ATP作为辅因子。 |
 | 高保真PCR酶具有 3´-5´核酸外切酶校对活性。当结合错误匹配的碱基时，DNA聚合酶停顿，导致合成暂延。合成暂延允许去除错误匹配的核苷酸并使用正确的核苷酸取代，从而大大提高扩增序列的准确性。Phusion Plus高保真DNA聚合酶是Phusion产品家族的新成员，它是融合了DNA结合结构域的类热球菌高保真酶。这种独特的蛋白质融合技术使Phusion Plus DNA聚合酶能够获得具有高准确度、灵敏度和抑制剂耐受性的PCR序列。此外，其专门配制的反应缓冲液使您无需计算引物退火温度即可进行PCR扩增，从而帮助节省时间并避免PCR运行中的错误。 |
3.质粒转染进大肠杆菌
 | TurboFect 体外转染试剂是一种专门的阳离子聚合物的无菌水溶液。聚合物和DNA一起形成结构紧凑，稳定带正电荷的复合物，保护DNA不被降解，从而有助于基因导入真核细胞。TurboFect是多种细胞转染的理想试剂，包括原代细胞和难转染的细胞。转染可以在在含血清或无血清条件下进行。和其他转染试剂相比，TurboFect展示了出色的转染效率和较小的毒性。 |
4. 大肠杆菌大规模培养
 | • 使用完全透明、抗裂、不含双酚A（BPA）的PETG制成 • 10-6的无菌保证水平（SAL） • 一次性使用，以减少交叉污染并无需清洗 • 带刻度，方便估计液体体积 • 可根据要求提供验证手册，以帮助您快速启动验证过程 • 可选择密闭或带过滤膜的瓶盖，便于适量的气体交换 • 平底或挡板底部，以满足减少剪切力或改善通气的需要。 |
 | T&J-Atype质粒培养生物反应器生物反应器/发酵罐提供更强功能和更多选择，满足工艺开发表征中的苛刻要求，适用于质粒DNA（PDNA)大规模生产、病毒载体生产、质粒表达、培养基优化、慢病毒制备、生产、悬浮细胞发酵法、采用贴壁细胞大规模生产慢病毒、采用悬浮培养生产慢病毒、重组大肠杆菌生产二倍体质粒的研究。 |
5.GMP质粒下游工艺
菌体收集： 平板膜包；澄清过滤： stax深层膜堆；浓缩换液： 超滤膜包；制剂混合：一次性搅拌罐；除菌灌装： 除菌滤器
澄清过滤 | • 高处理量 (50 ‒ 20,000 L) • 小系统<1 m2 (<10 ft2) • 操作简易 • 功能多样 • 可线性放大 • 使用成本低 • 核心材质：Seitz 系列滤板 • 内部结构：Supradisc II 膜堆构造 |
浓缩换液 | Omega PES膜材质的T系列膜包专为研发、中试以及生产规模的TFF应用而设计，结合材料和设计方面的显著改进，具有更可靠的流体动力学参数，T系列膜包适配于Centramate夹持器，可以提供最小200cm2 (0.215ft2)到0.5m2(5.4ft2)不同的有效过滤面积(EFA) |
除菌过滤
除菌过滤型号 | 滤膜材质 | 产品特性及优势 | 除菌过滤验证 | 渐变预过滤膜层 | 适用料液 |
Supor EKV | 独特的高密度非对称双层聚醚砜滤膜（PES) | 良好的结构和过滤性能； 超级打褶的过滤器结构和小内核设计； 高病毒回收，有效保障无菌工艺； 综合了良好的容污能力(寿命)和产品回收率。 | 经过验证, 有《验证指南》 备索 | 表层滤膜0.65μm，底层滤膜0.2μm | 常规滴度（<106) |
Supor ECV | 表层滤膜0.2μm(公称精度)，底层滤膜0.45μm | 高滴度 (106-108) |
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从针头滤器到30寸滤芯的不同规格尺寸，满足从实验室到生产规模的各种需求。
 | Allegro 2D 生物容器经过特殊设计，尤其适用于需要 可靠而灵活的生物容器的应用。可提供50 ml到 50L的2D生物容器，整合了生物容器的一次性 系统是经已证明的经济有效的替代设备，可替代玻璃、不 锈钢和硬塑料等材质的容器。这些一次性系统广泛用于生 物制药行业的上游、下游和制剂灌装工艺。 |
 | Palltronic Flowstar V 完整性检测仪根据现行的 GAMP 指南开发并验证，可适用于所有洁净室环境。它具有能够在符合21 CFR Part 11要求的环境中运行的全面技术控制和功能，同时还具有质量风险管理功能，如数据完整性控制和电子记录/电子签名。 |
6. 质粒纯化：
Invitrogen PureLink Expi 低内毒素及无内毒素质粒提取试剂盒；GENEJET 质粒制备试剂盒，GENEJET PCR纯化试剂盒。
 | Invitrogen PureLink Expi 无内毒素质粒纯化试剂盒采用新型专有阴离子交换树脂，以现行标准方案约一半的时间分离高级转染级质粒 DNA，获得内毒素水平低于 0.1 EU /μg 的质粒，推荐应用于敏感细胞（原代细胞、干细胞）的转染、基因疗法研究、基因组工程和蛋白质表达等。 |
二.质粒酶切、线性化，体外转录合成 mRNA
1.修饰核苷酸
2.限制性内切酶，T7 RNA聚合酶，转录酶
3.转录后修饰：Cap0 牛痘病毒加帽酶、 Cap1 2’-O-甲基转移酶，PolyA加尾酶
4.RNA抑制酶，DNA酶（降解模板DNA），无机焦磷酸酶
三. mRNA GMP纯化及制剂：
1. 切向流过滤（纯化浓缩）：
Omega T 300KD PES 切向流膜包
 | Omega PES膜材质的T系列膜包专为研发、中试以及生产规模的TFF应用而设计，结合材料和设计方面的显著改进，具有更可靠的流体动力学参数，T系列膜包适配于Centramate夹持器，可以提供最小200cm2 (0.215ft2)到0.5m2(5.4ft2)不同的有效过滤面积(EFA)。 |
2. 离子交换层析：
Mustang Q 膜层析
 | • 大孔道:0.8μm开放性孔道，更易捕获大分子（大分子量的蛋白，DNA和病毒）； • 传输流:在大孔道中大病毒颗粒（20-150nm）有更快的质量传递，与Q基团接触﹑结合﹑洗脱无障碍，动态载量不受高流速限制； • 低压力、低剪切力:保护脆弱病毒粒子； • 化学兼容性好:再生容易，有效节约经济成本； • 高流速（10MV/min)，低压差，有效缩短工艺时间； • 高载量，高分辨率，高回收。
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3. mRNA与正电荷材料复合（微流控包装LNP）：
PNI NanoAssemblr 平台解决方案。
4：LNP纯化/浓缩：
SPTFF单向切向流技术平台
 | • 无回流/循环管路 ； • 流量比率控制 (FRC) ； • 5-10X 浓缩倍数低进料速度； • 2-3X 缩小管路尺寸 ； • 无需按照批次进行 ； • 更小工作体积易于回收 ； • 无混合或气泡问题，低剪切作用。
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