生物制药洁净密码：内毒素检测与控制策略全解析
2025/04/18
什么是细菌内毒素？
细菌内毒素（Endotoxin）是一种由脂多糖（LPS）、蛋白质和磷脂组成的复合物，分子量约1×10⁶～20×10⁶Da，来源于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌等）的细胞壁中。当革兰氏阴性菌积极生长时少量释放内毒素，在死亡或分解后大量释放内毒素，表现出毒性。
内毒素单位为EU，一般以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U（活性单位）表示。
热原是否就是内毒素？
热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原，但热原不等于细菌内毒素。在药检范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，一般认为无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
细菌内毒素的毒性反应？
1.发热反应：细菌内毒素能引起发热反应，这是由于其刺激免疫细胞释放内源性致热原，致热原作用于下丘脑体温调节中枢，使体温升高。
2. 炎症反应和免疫损伤：内毒素可激活免疫细胞，释放大量炎症介质（如细胞因子、趋化因子等），引发局部或全身炎症反应。适度的炎症反应有助于清除病原体，但过度或持续的炎症反应可能导致组织损伤、器官功能障碍，甚至发展为全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）。
3. 内毒素血症与内毒素休克：当大量细菌内毒素进入血液，可引起内毒素血症，严重时可导致内毒素休克。内毒素休克是一种急性循环衰竭状态，表现为低血压、组织灌注不足、多器官功能障碍等，是革兰阴性菌感染的一种严重并发症，病死率较高。
4. 器官损伤：
肝脏损伤：细菌内毒素可损伤肝细胞，导致肝功能异常，严重时可能引起肝衰竭。
肾脏损伤：内毒素可引起肾脏血管收缩，导致肾脏缺血和肾小球滤过率下降，可能导致急性肾损伤。
心脏损伤：内毒素可影响心肌细胞功能，导致心律失常、心肌损伤，甚至心力衰竭。
肺损伤：内毒素可引起急性肺损伤，严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。
胃肠道症状：内毒素可引起肠道菌群失衡，导致腹泻、恶心、呕吐等胃肠道症状。
内毒素的检测方法
《中国药典》提供了细菌内毒素检测的详细指导意见，主要方法包括凝胶法和光度测定法。
热原检查：通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。
凝胶法（QC常用）：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
光度法：包括浊度法和显色法，可定量检测内毒素的含量。
内毒素控制策略
生物制品中内毒素的来源主要有：菌毒种、生产环境、不规范操作、设备及器械、原辅材料等。对于生物制品生产中内毒素污染的控制最主要的措施是生产过程控制，即严格按GMP要求进行生产，严格无菌操作，防止内毒素产生。
内毒素对热的耐受性非常强，常用的湿热灭菌法(121 ℃，1 h)不能破坏内毒素。破坏内毒素生物活性的最有效方法是干热灭菌法。一般180℃ 3～4 h、200℃ 60 min或250℃ 30～45min，或用强碱强酸才能彻底破坏它。
生物制药中内毒素去除策略
生物制药中的每一个环节都有可能污染内毒素使产品不合格，不仅给生产企业造成很大的经济损失，也会直接影响该企业的信誉和形象。随着国家药监部门对生物制品质量的要求不断提高，对内毒素的要求也越来越高。
细菌内毒素的去除可采用亲合层析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、超滤法、吸附法等。
亲和层析
内毒素的类似物多粘菌素B结合琼脂糖微球制成填料，可特异性的与内毒素结合，去除内毒素，目前这种方法主要用于科研及微量样品中内毒素的去除，工业生产中，由于成本昂贵且每个内毒素分子之间性质差异较大，这种亲和层析的去除效果有限。工业上目前主要还是用离子交换层析法去除内毒素。
凝胶过滤层析
内毒素在0.4M硫酸铵等盐的环境中，聚集成超大分子，通常大于1000KDa,而目标分子相对很小，可以通过凝胶过滤层析如S-200进行分离。
深层过滤
深层滤器结合不同的机理，如疏水结合、离子吸附以及分子大小筛选去除内毒素，而其效率取决于许多因素，如滤器材质 (如纤维素、活性炭、硅藻土等)、产品流体特性(如粘度、细胞碎片数量、温度等) 和流体颗粒特性(如硬度、颗粒大小、聚集性、胶体活性等)。由于通常情况下内毒素带负电荷（等电点在2左右），因此带有正电荷修饰的滤器对内毒素的去除效率较高，去除能力可达4-5个log。
疏水层析法
由于内毒素的脂肪A部分有很强的疏水性，因此可以通过和目标蛋白的疏水性差异，使用疏水作用层析进行分离，其去除能力可以达到3-4个log。但内毒素分子会通过聚集而减少疏水结构的暴露，从而使得疏水层析对内毒素清除的效率有所降低，所以需配合添加螯合剂或吸潮剂减少内毒素的聚集体产生从而提高去除效率。
阴离子交换层析
内毒素在常规抗体纯化工艺使用的工艺条件中带负电荷，因此能在阴离子层析操作中去除。一般来说，阴离子层析可以清除3-4个log的内毒素。通常可通过调节上样载量和柱上驻留时间、pH等提高内毒素去除效率。研究显示，使用比目标蛋白等电点略高的pH能增加蛋白表面的负电荷，有助于减弱内毒素与目标蛋白的非特异性结合，但也会导致流穿模式下目标蛋白和填料的弱结合，因此需在产品质量和收率之间的进行取舍和平衡。
超滤去除法
一般内毒素的相对分子质量在10KDa以上，以聚体形态分子量能超过100 kDa、直径达到约0.1μm。因此，可以使用 30-100 kDa孔径大小的膜去除内毒素。这种方法一般只适合目标分子较小的物质去除内毒素。
内毒素的控制理念
生物制品的成分都是比较复杂的，几乎所有的生物制品都是复杂的混合物，不容易进行鉴定或者表征。在整个生物制品的生产过程中非常容易受到微生物地的污染，而这些产品往往又是不耐热的，无法通过终端灭菌来实现无菌控制的，所以我们往往需要从最初的生产步骤就开始对微生物进行控制。以抗体药物的原液生产为例，它的生产工艺主要包括上游生产和下游生产，各大公司在生产操作中都会采取特定的微生物控制策略。
生产车间必须是符合GMP要求的洁净厂房，严格按规定进行清洁消毒，并定期对洁净间进行沉降菌和尘埃粒数检测，合格后方可使用。细菌内毒素很容易吸附在容器上，生产中任何直接接触制品的设备、容器、生产用具、管路、包括检测取样吸管、试管等必须保证无热原。耐热器具如玻璃、不锈钢等应进行干热灭菌。不耐高温用具，如胶塞、胶管等，可采用0.2 M氢氧化钠或盐酸浸泡4 h以上，然后用新鲜注射用水冲洗至中性，再高压灭菌。保证注射用水新鲜无热原。化学原材料应尽量选购无热原的，常用的化剂可干热灭菌。
操作者必须严格按SOP更衣、洗手、消毒。对于任何非封闭系统的操作，均应采取无菌操作方式。
在商业化生产阶段需要对每批配制好的培养基进行微生物限度和内毒素的取样检测在整个细胞培养的过程中与产品直接接触的设备耗材都是经过灭菌或直接使用一次性耗材。这个过程其实是处于一个无菌的状态，也是非常可控的，这个过程其实是不需要进行内毒素检测的。在细胞收获阶段，由于这个过程不是无菌操作，所以可以对细胞收获液进行取样检测微生物限度和内毒素。这两个结果可以反映出在整个收获阶段微生物控制状况是如何的。常规的下游生产工艺包括洗脱、层析步骤、病毒灭活、过滤、超滤、分装等。像先脱、层析后可以对细菌内毒素和微生物负荷进行检测。
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