产品介绍 | NEB限制性内切酶
2025/05/29
一、限制性核酸内切酶的定义
限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease）是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA链的核酸水解酶。这类酶主要来源于原核生物（如细菌），是原核生物抵御外源DNA（如噬菌体）入侵的“分子剪刀”，通过切割外源DNA保护自身基因组。
其核心特点包括：
序列特异性：识别特定的 DNA序列（通常为 4-8个碱基对的回文序列，如EcoRI识别 GAATTC）。
切割方式：在识别序列内或附近切割DNA，产生黏性末端（如EcoRI切割产生5'突出末端）或平末端（如SmaI切割产生平末端）。
二、限制性内切酶的分类
根据酶的结构、辅因子需求及切割特性，可分为以下四类：
1
I类酶
结构：由多个亚基组成，兼具甲基化酶和核酸内切酶活性。
识别序列：长（约 15 bp），包含特异性识别位点和非特异性辅助位点。
切割特点：切割位点远离识别序列（可达千碱基对），无固定位置，难以用于基因工程。
代表：EcoK、EcoB。
2
II类酶
结构：单一亚基，仅含核酸内切酶活性，甲基化需独立酶催化。
识别序列：短（4-8 bp），多为回文对称序列。
切割特点：严格在识别序列内或附近固定位置切割，产物末端明确，是基因工程中最常用的类型。
代表：EcoRI（识别 GAATTC，切割产生黏性末端）、HindIII（识别 AAGCTT）、SmaI（识别 CCCGGG，产生平末端）。
3
III类酶
结构：由两个亚基组成，兼具甲基化和切割功能。
识别序列：约10bp，非对称序列。
切割特点：切割位点在识别序列下游 24-26 bp 处，位置不固定，应用有限。
代表：EcoPI、HinfIII。
4
IV类酶
功能：特异性识别并切割修饰后的 DNA（如甲基化、糖基化 DNA）。
应用：主要用于研究 DNA 修饰机制，在基因工程中较少使用。
三、限制性内切酶的应用
1
基因工程与分子克隆
DNA 切割与重组：切割目的基因和载体（如质粒），通过黏性末端或平末端连接构建重组 DNA 分子。
载体构建：用于插入外源基因、筛选标记基因等。
2
DNA分析与指纹图谱
限制性片段长度多态性（RFLP）：通过酶切不同个体的 DNA，分析片段长度差异，用于遗传病诊断、亲子鉴定、法医物证分析。
基因组图谱绘制：酶切基因组 DNA，通过电泳分离片段，构建物理图谱。
3
基因诊断与突变检测
检测基因中特定序列的缺失、插入或突变（如镰刀型贫血症的β-珠蛋白基因检测）。
PCR-RFLP：结合PCR扩增，酶切产物分析突变位点。
4
其他应用
基因编辑辅助工具：在CRISPR-Cas9系统中，部分限制酶可用于验证靶点切割效率。
病毒检测：酶切病毒基因组，分析病毒亚型或变异。
四、限制性内切酶活性的影响因素
1
温度
最适温度：多数酶为 37℃（如EcoRI），少数来自嗜热菌的酶需更高温度（如 TaqI 为 65℃）。
低温影响：低温下酶活性降低，但通常不会失活（可在冰上操作防止 DNA 降解）。
2
缓冲液成分
金属离子：需 Mg²⁺作为辅因子（部分酶需 Mn²⁺，但可能降低特异性）。
盐浓度：不同酶对NaCl浓度需求不同，分为高盐（>100 mM）、中盐（50-100 mM）、低盐（<50 mM）缓冲液。
pH 值：多数酶最适pH为7.2-7.6，极端 pH会导致酶变性。
3
DNA 质量与结构
纯度：DNA中的杂质（如酚、氯仿、乙醇、蛋白质、RNA）会抑制酶活性，需纯化处理。
甲基化状态：原核生物中的限制酶会被自身甲基化酶修饰的 DNA（如Dam甲基化的GATC序列）所保护，不切割自身基因组，但会切割未甲基化的外源 DNA。
DNA 浓度与构型：超螺旋质粒DNA较线性DNA更难切割，需增加酶量或延长反应时间。
4
酶的用量与反应时间
星号活性（* 活性）：酶用量过高、甘油浓度 > 5%、低离子强度或存在有机溶剂（如乙醇）时，酶可能切割非特异性序列，导致 “星号活性”。
反应时间：常规酶切需 1-2 小时，不完全酶切可通过缩短时间或减少酶量实现（用于基因组物理图谱构建）。
5
其他因素
甘油浓度：酶储存液中甘油浓度通常为50%，反应体系中甘油浓度需低于5%（避免星号活性）。
抑制剂：EDTA（螯合Mg²⁺）、SDS（破坏酶结构）等会抑制酶活性。
NEB与限制性内切酶
1975年，NEB成为第一家销售限制性内切酶的公司，并开展限制性内切酶相关的研究与开发项目，进行限制性内切酶的发现、克隆、测序和表征，以及质量提升与生产优化等工作。截止到2008年的统计，NEB科学家发现了500多种限制性内切酶，这些科学家不仅包括NEB内部科学家，还包括许多来自海外的合作研究人员。作为分子生物学发展历史上的重要书写者，限制性内切酶未来必将与更多激动人心的应用相结合，推动科学历史的进步与发展。而NEB仍然将是这段历史及未来的重要参与者及推动者。
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