细胞江湖生存指南：从“手忙脚乱”到“游刃有余”的完全修炼手册

细胞培养，生命科学研究的基石，却也常是新手科学家的“噩梦”。一招不慎，满盘皆输——污染、状态差、莫名死亡… 如何在这片“江湖”中立足？这份融汇权威指南与实战经验的秘籍，助你功力大增！

超净工作台/生物安全柜：操作核心区域！使用前紫外灭菌≥30分钟，关闭后通风10分钟再操作；台面及放入物品表面均需用75%乙醇彻底擦拭。

个人防护：实验服、手套（操作前喷酒精）、口罩、护目镜缺一不可。

培养基、胰酶（Trypsin）、PBS等使用前需37℃水浴预热约15分钟。警惕：长时间预热会导致成分（如生长因子、谷氨酰胺）降解！

完全培养基：基础培养基 (如DMEM/ RPMI-1640) + 10%胎牛血清 (FBS) + 1%双抗 (青霉素链霉素)；FBS需-20℃保存，避免反复冻融。

HyClone基础培养基

HyClone胎牛血清

HyClone青霉素-链霉素溶液

胰蛋白酶-EDTA：常用浓度0.05%-0.25%，4℃保存，使用前预热。关键：消化前必须用无钙镁离子的PBS充分冲洗细胞，去除血清抑制。

HyClone 胰蛋白酶溶液

冻存液：90% FBS + 10% DMSO，现配现用；DMSO有毒性且溶解放热，勿直接加入细胞悬液。

谷氨酰胺：细胞生长必需！极不稳定，需-20℃单独保存，使用时加入培养基。含谷氨酰胺的培养基4℃储存超过2周需补加。

准备：预热完全培养基，备好含5-10mL培养基的离心管；

速融：从液氮取出冻存管（戴防护面罩防炸管），立即投入37℃水浴，轻柔但快速摇动，1-2分钟内完全融化；

稀释离心：酒精擦拭冻存管外壁。将细胞悬液转移至含预热培养基的离心管中，混匀（稀释DMSO毒性）。800-1000 rpm 离心5分钟，弃上清；

重悬培养：用新鲜预热培养基轻柔重悬细胞，接种至培养瓶，补足培养基，并标记细胞信息；

关键点：24小时后务必换液，去除残留DMSO和死细胞。

2.1看时机：显微镜下确认细胞密度达80-90%汇合。过密影响状态，过稀延长停滞期。

2.2清残留：吸弃旧培养基。关键：加入PBS轻柔摇晃清洗1-2次，彻底去除残留血清（抑制胰酶）。

2.3巧消化 (核心)：加入适量预热的胰酶（如T25瓶加0.5-1 mL），轻轻摇动覆盖细胞层；37℃孵育，需密切显微镜观察（30 s-1 min观察一次），观察到细胞变圆、间隙增大（非完全脱落）立即终止；

终止：加入2-3倍胰酶体积的含血清完全培养基。

2.4轻柔吹打：用移液管按顺序、贴壁吹打瓶壁，使细胞脱落形成单细胞悬液。避免产生气泡、暴力吹打造成物理损伤。对于难消化细胞，可“分层消化”，先收集已脱落细胞。

2.5离心分瓶：细胞悬液离心（同复苏），弃上清，之后用新鲜培养基重悬，按合适比例（参考细胞特性，如HEK293常1:5-1:10，干细胞1:2-1:3）分入新瓶，补足培养基，混匀。

直接法：让细胞自然沉淀（5-10分钟），吸弃部分（1/2-2/3）旧培养基，补足新鲜培养基，混匀后按比例分瓶。

离心法：细胞悬液转移至离心管，离心（同贴壁细胞），弃上清，新鲜培养基重悬，按比例分瓶。

要诀：悬浮细胞对密度更敏感，需严格按推荐密度传代，避免过密或过稀。

4.1选良材：选择对数生长期、状态良好的细胞。冻存前一天可换液。

4.2制悬液：按传代方法消化收集细胞，离心弃上清。用预冷的冻存液重悬细胞，调整密度至5×10⁶ ~ 1×10⁷ cells/mL。分装至冻存管（1-1.5 mL/管），标记清晰（名称、代数、日期）。

4.3程序降温 (成败关键)：

黄金法则：慢冻（约1℃/min）减少冰晶损伤。

经济法（冻存盒）： 4℃ 30 min → -20℃ 2小时 → -80℃过夜 → 次日转入液氮长期保存。强调：4℃平衡30 min不可省，利于冻存液渗透。

最优法：程序降温仪。

4.4验真身：冻存24小时后，复苏一管检测活性和是否污染。

1.1勤观察：每日显微镜检查！看形态、密度、有无污染（浑浊、漂浮物、菌丝）；

1.2定期换液：一般每2-3天，高密度细胞需更勤；培养基变黄（酸中毒）是强烈信号；

1.3培养箱维稳：严格监控CO₂(5%)、湿度(>95%)，定期灭菌水盘；

1.4控制代数：使用低代数细胞（通常< passage 20），定期更换新批次，避免遗传漂变。

1. 双抗用不用？非必需！长期使用可能掩盖轻度污染并产生耐药性，可以根据实验室洁净度决定。

2. 细胞碎片多？贴壁细胞：PBS冲洗2-3遍；悬浮细胞：PBS重悬离心洗涤2-3遍。

3.-80℃能存多久？仅适合短期（1-2周），长期保存必须用液氮。

4. 培养瓶盖子怎么拧？密闭盖：旋进约2/3，预留缝隙通气。透气盖;按说明操作。

5. 细胞不贴壁？检查：消化是否过度？新血清批次是否不适应？培养皿是否需要包被（如原代细胞）？

6. 细胞状态差（颗粒多、生长慢）？排查：支原体污染？血清质量问题（换批次/品牌）？CO₂浓度不准？培养基过期或配制不当？

7. “慎与勤”心法 ：

慎防污染、慎操作（温柔）、慎思（步骤清晰）；

勤消毒（台面、手）、勤换液传代冻存、勤观察。