【技术干货】ADC药物质控指标及检测方法

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）被誉为“生物导弹”，通过一个巧妙的连接子（Linker）将高活性的细胞毒性小分子药物（Payload）精准地靶向递送到肿瘤细胞。这种设计相对其他癌症治疗手段而言，可以具有更高的疗效以及更低的全身毒性，是肿瘤治疗的最前沿方向之一。

然而，ADC的结构极其复杂。它不仅是单克隆抗体、连接子和payload的简单加和，更是一个高度不均一的混合物，其质量分析挑战体现在多个方面。因此，对ADC的质量控制必须建立一个多维度的、深入的分析体系，以精确表征这些关键质量属性。

药物抗体比指抗体偶联Payload数量的平均值，直接反映了靶向肿瘤细胞的载荷数量，同时影响药物的安全性与有效性，是ADC药物核心指标，生产放行必检项。

目前DAR值分析方法主要有两类：液相色谱法（HPLC-UV），包含疏水作用色谱（HIC-HPLC）和反相液相色谱（RP-HPLC）；质谱法（LC-MS）。

HIC-HPLC：因Payload通常是疏水性的，偶联不同数量的Payload的药物之间疏水性不同，利用该性质可实现在HPLC体系中的分离，未偶联Payload的抗体疏水性最弱，优先被洗脱，偶联Payload数量越多的抗体，其疏水性就越强。根据偶联不同Payload药物峰面积加权平均得到DAR值。该方法为DAR值分析金标准，亦可用于样品纯化，但同样存在异构体共洗脱、疏水性差异较小组分共洗脱等问题。

RP-HPLC：该方法需要将ADC进行处理，得到还原ADC的DAR种类，这些片段能在RP-HPLC条件下可以很好地分开，并用来计算平均DAR。该分析方法可能导致片段的二次破坏，影响分析结果。

LC-MS：该方法利用不同的DAR值组分在高分辨质谱的分析下具有不同的质荷比（m/z）这一特点，实现不同组分出峰的分离，用来计算平均DAR值。该方法理论准确度高，灵敏度高，可区分小差异组分，但受离子化效率差异影响，高DAR值组分检测结果可能低于实际值，同时，其数据解析更为复杂。

完整分子量是指测量整个ADC药物分子的精确质量。测定完整分子量的根本目的是为了确认目标蛋白的基础结构是否正确，并发现预期之外或微小的结构变化，以指导工艺优化，主要包括：

一级结构确认：确认生产的蛋白质的氨基酸序列是否正确，分子量是否与理论值一致。

检测翻译后修饰：识别和量化常见的会导致分子量变化的修饰，如糖基化、氧化、脱酰胺、N-末端焦谷氨酸化、糖化等。

评估异质性：明确聚体、碎片或其他修饰变体的存在。

其检测方法为LC-MS法，通常使用反相色谱或尺寸排阻色谱进行脱盐和初步分离，将蛋白质与盐分等杂质分开后，利用质谱进行分析得到结果。该方法能提供全局试图，可快速评估样品质量，但无法具体定位异常点的位置，同时，对复杂样品解析能力有限。

游离小分子药物是未通过连接子与抗体共价结合的、单独存在的小分子物质，它主要包括Payload和Linker-Payload两种形式，主要来源于生产、储存或体内循环过程中，未成功偶联以及连接子的不稳定性断裂。由于Payload具有强毒性，游离小分子进入人体会无差别杀伤正常的细胞，因此检测游离小分子药物是一项关键的安全指标。

其常用检测方法有RP-HPLC、LC-MS法等，样品通常需要经过有机溶剂处理，实现蛋白沉淀，取上清液进行检测。该处理方式对样品进行了稀释，对于本就低浓度的游离小分子检测灵敏度具有更高的要求。同时，样品处理过程可能导致游离小分子被包裹沉淀，因此，需探究该过程多因素对准确度的影响。

抗体纯度的目的至关重要，直接关系到药物的安全性和有效性。聚体可能失去结合活性，并可能引起免疫反应，片段可能影响其介导的免疫细胞杀伤功能或半衰期，其他工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白、DNA等）可能引起过敏或其他不可预测的毒性反应。高纯度是保证每剂药物都能发挥预期疗效的基础，抗体纯度为放行必检项。

目前，抗体纯度通常通过SEC-HPLC、CE-SDS方法进行检测。SEC法利用不同物质分子尺寸大小进行分离，实验条件温和，可以将单体、聚体、片段分离开并进行定量，但对于大小相同但结构不同的杂质无法分离，如：共价聚体与非共价聚体。CE-SDS法可用于检测片段、降解产物、非糖基化重链等，其对比SEC法具有更高的分辨率，能分离相同大小不同特性的分子，但其定量精密度和准确度相对更大，且其方法开发设计参数更多，更具挑战性。

抗体纯度在实际生产中通常需要多维度交叉验证进行，根据产品特性选择合适的方法组合，以达到质量监测、控制的目标。

分子大小异质体：主要用于检测和量化药物中的单体、聚体（如二聚体、多聚体）及片段等不同大小的分子形式，以确保药物安全和质量稳定性。分析手段与抗体纯度分析一致，侧重于定量研究异质体含量，监控不同异质体含量变化趋势，明确产生途径，加以控制。

电荷异质体：由于细胞生产的复杂性以及蛋白质自身的不稳定性，它们通常会经历多种翻译后进行修饰，这些修饰会改变分子表面的净电荷，从而形成一系列电荷变异体。除了主峰（预期的、电荷中性的目标产品分子）外，还包括酸性峰（通常由脱酰胺、氧化、糖链唾液酸化等修饰引起）、碱性峰（通常由C末端赖氨酸截除不完全、N末端焦谷氨酸化不完全、琥珀酰亚胺环化等修饰引起）。电荷异构体可以用来评估产品存储运输的稳定性（如酸碱性峰的增加代表不同途径的降解），同时对生物活性具有较大影响，可能影响抗原的结合，从而影响药效和药代动力学。

电荷异构体常用的检测方法有毛细管等电聚焦电泳（iclEF）法和离子交换色谱法（IEC）。IEC：在低于抗体等电点的pH条件下，抗体带正电，与带电的色谱柱固定相发生相互作用，通过改变pH或者逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱来达到分析物分离的目的，方法分辨率相对较低，开发难度较高。iclEF：在毛细管中形成pH梯度，蛋白质在电场作用下迁移至其等电点位置。方法分辨率高、分析时间段、开发难度低，但定量精密度略有不足。针对电荷异质体分析，iclEF已被多国药典收录，IEC虽然是作为基础色谱技术被收录，但多个产品实际使用该方法进行放行，具备较高的认可度。

偶联位点作为ADC药物研发阶段核心技术点，该分析有助于了解偶联工艺，并在早期研究中监测特定位点水平的药物载量，验证工艺开发期间不存在非预期的偶联产物，并确保可比性研究中结合水平的批间一致性。连接子由于偶联位点的不同可能表现出不同的稳定性，这受到溶剂可及性和局部电荷的影响，这可能进一步导致不同的药代动力学和不同的脱靶毒性，为了确保产品质量和一致性，不仅要精确控制偶联过程，而且偶联位点分析对于表征初始药物偶联状态和监测位点特异性水平的后续变化也至关重要。

目前，该项目的检测手段为LC-MS法，使用蛋白酶将抗体切割成一系列肽段，利用液相色谱手段分离后，利用质谱进行检测，通过对比ADC和裸抗的肽图色谱图确认载药肽段，通过对载药肽段进行碰撞诱导解离，读取该肽段的氨基酸序列，最终精确锁定Payload的连接氨基酸位点。目前，该方法主要面临技术复杂、开发耗时、难定量等问题。

一级结构确认是指确证蛋白质的氨基酸序列（包括末端修饰）与根据基因序列推导的理论序列完全一致，确定产物为目标抗体。其检测方法与偶联位点检测一致，通过肽段的分子量和序列信息与理论蛋白质序列数据库进行比对完成。

药物整体DAR值分析与一级结构确认、偶联位点分析，共同构成药物的载药分布信息，直接影响药代动力学、疗效和毒性。

Payload具有高活性和高毒性，是ADC药物核心杀伤武器。目前主要有微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂两类。微管蛋白抑制剂通过破坏微管动态平衡，导致细胞周期停滞和凋亡，达到细胞杀伤目的。DNA损伤剂能通过直接切割或与DNA产生交联的方式，引发细胞的死亡。Linker作为链接ADC和抗体的重要部分，应在抵达目标细胞内部后发生断裂，其在血液循环中的稳定性是重点关注目标。主要包括可切割连接子和不可切割连接子两类，前者特定条件下（如酸性环境、还原条件或酶作用）释放Payload，能起到较好的“旁观者效应”（范围杀伤细胞），但具有提前释放的风险；后者血液循环中非常稳定，Payload的释放依赖于抗体在溶酶体中被完全降解。

目前，二者或联合设计产品作为原料药关注化学结构、纯度、有关物质（副产物、起始物料、降解物）、含量等关键参数，HPLC、LC-MS是分析主力方法。分析难点集中在部分Linker分子量较小、无紫外吸收基团，带来一定开发难度，以及Payload-Linker的稳定性研究，包括强制讲解，以及体内非靶向环境的稳定性研究。

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