产品推荐 | NEB快易无缝克隆预混液

NEB 中国新推出的快易无缝克隆预混液 （货号#M5522），该产品可在等温条件下，通过一管式反应，快速高效组装 2-3 个带有重叠末端的 DNA 片段。仅需 15 分钟，即可完成无缝克隆，大幅提升实验效率

快易无缝克隆预混液基于 Gibson Assembly 原理开发，可突破 DNA 片段长度及末端匹配性限制，实现多片段高效组装。对于较大的 DNA 构建体而言，该方法易用、灵活、适用性强，因此已被合成生物学领域广泛采用。

无缝克隆的 “三酶协同” 是在同一等温体系（50℃）下，通过核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶的精准配合完成组装，具体机制如下：

1. 核酸外切酶（5'→3' 方向）：仅消化 DNA 片段的 5' 末端磷酸二酯键，产生单链 3' 突出端（长度由酶活性与反应时间调控，通常为 15-30nt），为同源片段退火提供互补单链区域；

2. DNA 聚合酶（高保真型）：以退火后的 3' 突出端为引物，利用反应体系中的 dNTP 填补片段间的缺口，且因无 5'→3' 外切酶活性，不会降解已退火的单链区域；

3. DNA 连接酶（NAD⁺或 ATP 依赖型）：识别并连接组装后 DNA 分子的单链切刻（nick），形成完整的双链闭合环状 DNA。

酶活性平衡是关键：

• 若核酸外切酶活性过强，会导致单链突出端过长甚至片段降解；

• 若聚合酶活性不足，缺口填补不完整会降低连接效率；

• 若连接酶活性弱，会导致组装产物以开环形式存在，影响后续转化效率。

NEB 今年最新推出的快易无缝克隆预混液，15 分钟搞定载体构建，正好赶上 NEB年末大促销：限时买 1 送 1，单次反应低至 ¥9.9！减小体系更划算！

• 超快速度：15 分钟完成 2~3 个片段无缝克隆，快速呈现实验结果。

• 零纯化步骤：PCR产物小于体系的20%，则可省去纯化流程，节省试剂成本。

• 大片段兼容：支持长达 20 kb 的片段组装，满足多样实验需求。

• 灵活设计：自由定制序列，不依赖限制性酶切位点，实验设计更灵活。

• 广泛适用：适用于质粒构建、基因合成、定点突变等多种实验场景。

• 高性价比：20 μl 反应体系，促销期间低至 9.9/反应，减小体系更划算！

为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：

• 细胞：感受态细胞的转化效率可能相差几个数量级。观察到的组装效率与用于转化的感受态细胞效率直接相关。

• 电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。将快易无缝克隆预混液产品用于电转化时，需要将反应液稀释 3 倍，并取 1 μl 用于转化。

• DNA：如果快易无缝克隆反应液中所有 PCR 产物的总体积不超过快易无缝克隆反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。PCR 产物体积过多会引入更多 PCR 产物中存在的 PCR 反应缓冲液和未使用的引物，从而降低快易无缝克隆和转化的效率。PCR 产物柱纯化可能会使快易无缝克隆和转化的效率增加 2 – 10 倍，在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。

• 插入片段：直接将片段组装到克隆载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2–3 倍。组装三个或更多片段时，建议使用等摩尔比的片段。

• 生物学特性：一些 DNA 结构，包括反向重复序列和串联重复序列，会被大肠杆菌选择性丢失。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化效率较低或菌落较小

快易无缝克隆采用Gibson组装技术，该方法可以在线性化载体的几乎任何位置插入一个或多个DNA片段，并且不依赖于特定序列中限制性位点的存在来进行合成或克隆。因此，用户可以完全控制组装的内容，并且可以避免由于多片段组装而引入无关序列。此外，相较于使用限制性内切酶的传统克隆方法，基于Gibson组装的快易无缝克隆速度更快。不仅如此，相较于传统克隆方法，快易无缝克隆可以在单次反应中更高效的连接多个DNA片段。

经过优化，反应的最佳温度为50°C，但实验证明在40°C至50°C之间反应也可进行。

组装2-3个片段时，建议温育时间为15分钟。通常不建议反应时间少于15分钟。延长温育时间（最长可达4小时）可能会提高多个片段的组装效率。不要将反应过夜。

已经证明，对于只有12bp 重叠末端的DNA片段也可以进行有效的组装。然而，这取决于重叠区域的GC含量。建议在对双链DNA进行组装时使用15bp或更长的重叠序列且Tm ≥ 48°C（A-T pair=2°C，G-C pair =4°C）。

快易无缝克隆预混液中的外切酶含量已经进行了优化，因此可以组装那些包含不超过100-bp重叠区域的DNA分子。

可以。为了获得最佳结果，每个较小片段的摩尔数应至少是载体的5倍（插入片段 : 载体 ≥ 5:1），并将反应中DNA的总量保持在0.02-0.5 皮摩尔

经过优化，反应的最佳温度为50°C，但实验证明在40°C至50°C之间反应也可进行。

可以。组装好的DNA分子是共价连接的，可以进行PCR扩增。此外，如果最终产物是闭合的环状DNA分子，它可以用作滚环扩增（RCA）的模板。

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