【技术干货】新手如何装一根高柱效层析柱
2025/12/24
层析柱
层析纯化实验中，当预装柱已经无法满足大家多样化的实验需求，需要我们将散装填料与空柱自行组装。但是，每种填料和空柱的性质各异，我们用什么样的方法，才能够装出质量优秀的层析柱呢？今天我们就为您带来各种层析柱的装柱方法。
图· 典型AKTA Pure 25 层析系统
?选择合适的空柱
以Cytiva层析空柱为例，提供三款层析空柱选择：XK、Tricorn和HiScale，满足各种不同的应用场景。
⚠注意：每一款层析柱都具有多种柱高与内径可供选择，我们可以根据实验的样品量、想要达到的分离效果以及填料的特性，去选择合适的尺寸。
?XK柱
中低压空柱，耐压在0.3 Mpa–0.5 Mpa，适合大部分的经典底耐压填料，如分子筛类Sephadex、Sepharose等；
★内径16/26/50mm，高度20/40/70/100cm，柱体积5-1800mL可供选择。
?Tricorn柱
中高压空柱，耐压在5 Mpa–10 Mpa，实验室常用，非常适合装填小粒径的高分辨率填料，例如SOURCE等；
★内径5/10mm，高度2/5/10/15/20/60cm，柱体积0-50mL可供选择。
?HiScale柱
中高压层析柱，耐压在2 Mpa，双调节杆和柱床刻度设计，特别适合在工艺开发阶段，配合新一代填料Capto和MabSelect系列使用。
★内径10/16/26/50mm，高度20/40cm可供选择。
?填料准备
根据柱床体积，计算需要的填料和匀浆体积：
(填料的压缩因子是一个经验参数，一般可以从填料的说明书当中，如常见压缩比1.1)
如果匀浆体积较大，超过了柱床体积，我们则需要使用装柱器或连接器，为装柱工作提供额外的体积
?确定方法（恒压/恒流）
恒流法：适用所有层析柱。琼脂糖基架填料建议先以低流速（30%Vmax）沉降填料，形成固态均一的柱床后，再以高流速（80%Vmax）进行压柱，柱床稳定后的高度即为最终柱床高度，因软胶填料容易变形，不建议过度压缩。待柱床高度稳定后，下探上柱头至实胶面。低流速压柱的好处包括减少颗粒沉降差异、提高排列整齐度、避免高压冲击柱床、减少颗粒间作用力、减少气泡产生等。
恒压法：适用压力敏感或难以均匀装填的填料，在整个装柱过程中压力保持一致，使用恒定压力来装填层析柱，随着柱床压实，流速会逐步降低直至稳定。对于琼脂糖结构填料，柱床稳定后的高度即为最终柱床高度。常规建议装柱过程控制ΔP 0.2 MPa左右。
层析填料装填常规步骤
排气操作：关闭柱底出口，通过“下进上出”方式冲洗底部气泡（顽固气泡可用恒流泵吸出）；柱底留存1-2cm缓冲液或纯化水。
填料填充：将匀浆好的填料一次性均匀倒入层析柱（沿玻璃棒或装柱器内壁缓慢注入），避免引入气泡。
沉降与压实：低流速（30-60cm/h）压柱使填料沉降，标记胶面位置；根据压缩因子计算最终柱高，调整柱头至目标高度。
柱床调整：待填料沉降后，补充缓冲液防止液面低于柱床；通过顶部适配器排出柱头气泡，确保分配盘分液均匀、筛网紧固。
平衡与验证：用平衡缓冲液冲洗柱床（2-3CV），可以考虑提高流速冲柱子，不要超过压力上限（预判到极限情况下的填料情况），直至流出液的电导率、pH与缓冲液一致（需3-5柱体积）
?测定柱效
原则：层析柱装填的优劣直接影响实验结果、分离效率及稳健性。柱效测定可以得到理论塔板高度与对称因子两个参数的结果；
一般来讲，理论塔板高度在3到5个粒径之间，对称因子介于0.8到1.5之间时，柱效就达到了满足要求的状态。
⚠注意：填料说明书上，会详细的写出填料适合的空柱型号，以及对应的装柱参数。
柱效测定主要有UV/Cond两种方法
?UV 积分法
适用条件：大多数填料（除疏水和反向层析）
流动相缓冲buffer：Pure Water
测试样品：1% 丙酮
上样体积：1%~2%CV (column volume)
积分曲线类型：UV _280紫外吸收峰
?Cond 积分法
适用条件：所有层析柱
流动相缓冲buffer：0.4 M NaCl
测试样品：如 1 M NaCl
上样体积：1%~2%CV (column volume)
积分曲线类型：Cond电导率
层析柱是分离纯化的核心工具，分离效果直接取决于装填质量与平衡状态。装填均匀性、柱床稳定性及平衡充分性是影响分离效果的三大关键步骤，任何环节的疏漏均可能导致峰形拖尾、分辨率下降或目标蛋白回收率降低。
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