【技术干货】反相之道，分离之艺——走进RPC的科学世界

 2026/02/04

反相层析（Reverse Phase Chromatography，RPC）是一种基于溶质极性差异的液相高分辨率分离技术，通过非极性固定相与极性流动相的相互作用实现物质分离，需要使用有机溶剂。

?技术原理

核心机制：利用溶质在非极性固定相（如C18、C8键合相）和极性流动相（如水/甲醇混合液）间的分配差异。极性物质更易溶于流动相而快速洗脱，非极性物质与固定相亲和力强而滞留，表现为极性大者先出峰12。
疏溶剂理论：溶质因流动相极性排斥作用结合至固定相疏水配基，保留时间与疏水性呈正相关。

?固定相与流动相

固定相类型：主要为化学键合非极性基团的载体，包括：

硅胶基：C18（十八烷基）、C8（辛基）、苯基等，适用于常规分离。
高分子聚合物：如聚苯yixi-二yixi基苯，耐酸碱且载样量高。

流动相组成：极性溶剂或混合液，常见水、甲醇、yijing，可调节极性强度16。酸（如0.1%三fuyisuan）或缓冲盐常添加以优化pH或离子强度。

?应用特点与优势

适用物质：涵盖肽段、核苷酸、糖类等小分子（分子量200-2000Da）及部分生物大分子（如蛋白质）。
技术优势：

分离效率高：相比正相层析，对极性相近物质的分离效率提升30-50%。
拖尾抑制：流动相水化层屏蔽硅胶表面硅羟基的非特异性吸附。
适用性广：占HPLC应用的80%，尤其适合天然产物、药物代谢物分析。

?操作参数与限制

关键参数：

pH控制：硅胶基柱适用pH 2.0-8.0，高分子柱耐受性更广。
压力与温度：操作压力10-40MPa，温度上限60℃以防止固定相降解。

操作限制：

强疏水性物质（logP>5）需离子对试剂改善洗脱。
生物大分子易变性，需优化流动相条件。

?应用领域

生物制药：蛋白质、多肽纯化（如单克隆抗体生产）。
药物与食品分析：药物代谢研究、农残检测。
天然产物分离：植物提取物中活性成分的纯化。

?反相层析和疏水层析对比

反相层析 (RPC) 与疏水层析原理类似，基于生物分子表面暴露的疏水基团与介质疏水配基之间的相互作用。不同的是，RPC所用到的基团疏水性更强，一般则使用超过8个碳原子的疏水侧链。而为实现洗脱，必须使用非极性有机溶剂（如yijing或甲醇）来打破这种相互作用。RPC是目前分辨率最高的层析技术，对于多肽、寡核苷酸的分离十分有效。

反相层析和疏水层析有着相同的分离机制‌：均基于样品分子疏水性的差异，通过疏水作用与固定相结合实现分离‌。但在操作使用上又有着一些差异：