分子克隆系列之位点特异性重组克隆 ——从 Gateway 到 Cre-LoxP，精准重组？

Gateway 克隆基于 λ 噬菌体的 att 位点（attB、attP、attL、attR）与重组酶的特异性反应，实现目的基因在不同载体间的定向穿梭，核心分为两步反应：

1. BP 反应：目的基因两端的 attB 位点与供体载体上的 attP 位点，在 BP 重组酶（含 Int、IHF、Xis 蛋白复合体）作用下发生重组，形成含 attL 位点的入门载体（Entry Vector），完成目的基因的捕获；

2. LR 反应：入门载体上的 attL 位点与目的载体（Destination Vector）上的 attR 位点，在 LR 重组酶（含 Int、IHF 蛋白）作用下重组，将目的基因定向转移至目的载体，实现穿梭。

整个过程无需酶切与连接，重组效率高达 90% 以上，且目的基因方向与阅读框保持不变。

图：Gateway克隆

（反应中的四种类型的质粒和酶混合物。红色箭头表示目的片段。）

完成 BP 与/或 LR 克隆后，下一步即可进行转化与阳性菌落筛选。由于入门克隆（entry clone）与目的载体（destination vector）携带不同的抗生素抗性标记，因此可通过抗生素轻松筛选出最终的表达克隆（expression clone）。 需要特别注意菌株选择：保存含 ccdB 基因的载体时，需使用CcdB 耐受菌株； 但在做 BP/LR 重组反应时，则必须使用对 CcdB 敏感的大肠杆菌，如 DH5、TOP 10、Mach1 等。 在重组发生前，ccdB 基因位于供体载体（donor vector）和目的载体（destination vector）上； 在 BP 或 LR 反应过程中，ccdB 基因会被目的基因替换掉。 由于 CcdB 蛋白会抑制敏感菌株的生长，因此最终长出来的菌落，绝大多数都为阳性重组克隆。关键点：1. 目的基因内部不能含有 att 位点的同源序列，否则会干扰重组。 2. PCR 扩增 attB 位点的引物，必须包含完整的 15 bp 核心序列，以保证重组效率。

Gateway克隆技术尤其适用于蛋白表达。目标载体和宿主系统选择的灵活性和多样性特别适合多学科蛋白表达研究。例如在酵母双杂交实验中，除了通过酶切连接，同源重组等方式构建载体筛选互作蛋白的Y2HGold-GAL4体系之外，还有利用Gateway技术的ProQuest系统。通过Gateway技术可以方便地将目的基因克隆到用于蛋白互作研究的载体上，如pDEST22和pDEST32等，并利用酵母菌株MaV203进行蛋白互作验证或筛库试验，进而可以揭示蛋白之间的相互作用关系，为理解生物体内的蛋白网络和功能提供重要信息。

Flp-FRT 系统源自酵母，核心是 Flp 重组酶（Flipase）与 FRT 位点（Flp Recognition Target）的特异性相互作用：

• FRT 位点是 13bp 的反向重复序列 + 8bp 的间隔序列（核心识别区域）；

• Flp 重组酶识别两个 FRT 位点后，催化 DNA 链的切割与连接：若两个 FRT 位点方向相同，可删除位点间的片段（如筛选标记基因）；若方向相反，可实现片段倒置；若位于不同染色体上，可介导染色体易位。与 Cre-LoxP 系统相比，Flp 重组酶在 37℃下活性较低，但在哺乳动物细胞中脱靶率更低，更适合精准的基因修饰。

1. 真核细胞载体改造，如去除哺乳动物细胞表达载体中的抗性基因，避免标记基因对细胞代谢的影响。

2. 植物基因编辑，如位点特异性插入目的基因（如抗虫基因），减少随机整合带来的表达差异。

3. 条件性基因表达，通过诱导型 Flp 重组酶（如四环素诱导），实现目的基因的时空特异性表达。

4. 与 Cre-LoxP 的协同应用：两者可形成双重组酶系统，如用 Cre-LoxP 实现组织特异性基因敲除，用 Flp-FRT 删除筛选标记，避免单一系统的位点干扰。

适用物种选择：植物细胞优先选择 Flp-FRT 系统（脱靶率低），动物细胞可根据需求选择（追求活性选 Cre-LoxP，追求精准选 Flp-FRT）。