蛋白纯化常见问题汇总（一）
2026/03/25
Q 使用注射器手动操作 HiTrap 柱子进行样品纯化，如何控制流速？ A 1 ml/min = 在 HiTrap 1 ml 柱子上近似 30 滴/min；5 ml/min = 在 HiTrap 5 ml 柱子上近似 120 滴/min。 Q 柱子有色素如何去除？ A 色素性质很复杂，可以根据填料的耐受情况，优先尝试 NaOH 清洗，另外，也可以使用有机溶剂（如 30% 异丙醇或乙醇），最后再尝试酸，如 0.01 M HCl。如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除。 Q 填料粒径如何影响离子交换的分辨率？ A 相对来讲，填料的粒径越小则分辨率越高，一般分辨率由高到底为：Capto HiRes（9 µm）、Source 15（15 µm）、Source 30（30 µm）、High Performance（HP，34 µm）、Capto ImpRes（40 µm）、Capto ImpAct（50 µm）、Capto（90 µm）和 Fast Flow（FF，90 µm）。但是粒径越小，反压也越高。而填料装填的高度越高分辨率也越高。另外，预装柱的柱效更佳。 Q 针对未知样品，如何选择离子交换层析填料和操作条件？ A 自然界中绝大部分蛋白的 pI 在 5.8 或 9 附近，偏酸性更多。因此，针对未知样品，一般首先推荐强阴离子交换层析，如 Capto Q，使用中性缓冲液 pH 7-8。如果 Q 挂不上，可以再尝试强阳离子交换 Capto S 或 SP，选择 pH 5-6 范围。另外，可以选择样品流穿，杂质挂柱。HiTrap Capto IEX Selection Kit（货号 28934388），含 Capto S、Capto Q、Capto DEAE、Capto adhere 以及 Capto MMC 1 mL 预装柱各一支，后两个为多模式填料，可用于填料筛选。 Q 等电点非常接近的两个蛋白，可以用离子交换分开吗？ A 首先，离子交换本身是基于蛋白「表面」的电荷分布而不是净电荷，因此并不完全依赖于 pI 差异；其次，蛋白纯化本身是基于样品和杂质的带电荷差异，即便对于 pI 很接近的两种蛋白，pI 曲线每个点的斜率不同，也可以摸索到某个 pH 条件，让二者带电荷量差异尽可能大，且样品稳定。建议优先尝试高分辨率填料（如 Capto HiRes 系列），减少上样量并且拉大洗脱梯度进行优化。 Q 如何确定离子交换层析填料的载量？ A 载量需要测试。动态结合载量（Dynamic Binding Capacity，DBC）是在实际样品操作条件下的结合能力。例如，对于离子交换层析，DBC依赖于溶液pH、离子强度、添加剂以及样品本身的性质。 另外，流速也会影响动态结合载量，一般来说，流速越低，动态结合载量越高，如果流速接近于零，动态结合载量等于静态结合载量。 层析填料的DBC是在给定流速条件下发生未结合蛋白显著穿透之前结合的目标蛋白量，通过绘制蛋白上样量与穿透百分比的曲线生成穿透曲线。DBC可在穿透曲线上测定，例如损失10%蛋白质。 Q 离子交换层析在平衡、上样阶段对buffer电导率有没有要求？ A 结合洗脱模式下，是低盐上样、高盐洗脱，平衡、上样阶段一般要求电导率＜3 mS/cm，再根据预实验的结果优化上样时的盐浓度，比如目的蛋白是在150 mM以上的盐浓度下被洗脱，则上样buffer中可以加入50-150 mM的盐，让结合相对弱的杂质流穿，目的蛋白结合上去。 Q 针对未知样品，如何选择离子交换层析填料和操作条件？ A 自然界中绝大部分蛋白的pI值在5.8或9附近，偏酸性更多。因此，针对未知样品，一般首先推荐强阴离子交换层析，如Capto Q，使用中性缓冲液pH 7-8。如果Q挂不上，可以再尝试强阳离子交换Capto S或SP，选择pH 5-6范围。 另外，可以选择样品流穿，杂质挂柱。HiTrap Capto IEX Selection Kit（货号28934388），含Capto S、Capto Q、Capto DEAE、Capto adhere以及Capto MMC 1 mL预装柱各一支，后两个为多模式填料，可用于填料筛选。 Q DEAE填料碱洗后，如何快速平衡回中性？ A DEAE作为弱阴离子交换剂，电离不完全，会在碱洗后很难从高pH条件平衡回中性。建议在碱洗后用10×Tris-HCl pH 7.8平衡，一方面利用其较强的缓冲能力，另一方面利用其较高的氯离子浓度，对填料中的氢氧根离子进行替换。清洗后可以保存在20%乙醇中。 Q 如何有效去除离子交换填料上的色素？ A 色素性质较复杂，可以根据填料的耐受情况，尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂（如 30%异丙醇）或酸（如醋酸）处理。 除了单一的清洗方式，也可以考虑使用混合试剂进行处理。如果0.5-1.0 M NaOH清洗效果不佳，可以分别尝试如下清洗方式： 方法1：30% Isopropanol ； 方法2：0.5 M NaOH+30% Isopropanol； 方法3：混合8 M 尿素+0.5 M 醋酸+2 M NaCl，该方法对于和阴离子交换等介质紧密结合的化合物，通常很有效； 方法4：0.5 M NaOH混合1-2 M 盐（比如NaCl）。 也可以将填料拆出，分别浸泡在不同试剂中，分成几组进行测试，根据测试结果选取色素去除效果zui好的方法进行清洗。 Q 如何根据蛋白pI选择离子交换填料类型？ A 对于已知等电点蛋白： 如果蛋白在等电点之下最稳定，缓冲液pH≤目的蛋白pI，选择阳离子交换剂； 如果蛋白在等电点之上最稳定，缓冲液pH≥目的蛋白pI，选择阴离子交换剂。 ● 缓冲液pH≥目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阴离子交换填料； ● 缓冲液pH≥目的蛋白pI 3个单位以上选择强阴离子交换填料； ● 缓冲液pH≤目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阳离子交换填料； ● 缓冲液pH≤目的蛋白pI 3个单位以上选择强阳离子交换填料。 对于未知等电点蛋白： 首先应选择阴离子交换剂，起始平衡液pH为8.0，然后再选择阳离子交换剂，起始平衡液pH为6.0 Q 抗体纯化的精纯步骤，选择 Capto adhere 和 Capto adhere ImpRes 什么差别，如何选择？ A 二者均为多模式强阴离子填料，主要区别在于粒径不同，Capto adhere 为 75 μm，和 Capto adhere ImpRes 为 40 μm。大部分抗体 pI 偏碱性，适合阴离子交换走流穿模式。另外，Capto adhere ImpRes 还可以在结合/洗脱模式下进行精纯，特别适合于具有中性或者偏酸性等电点的抗体，同时对片段和异构体的去除也有很好的效果。 ?ÄKTA层析系统选型指南 赋能生物分子纯化，加速科研与产业突破
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