技术干货 | 超长读长 + 实时测序：ONT 三代测序与 NEB 解决方案

Oxford Nanopore Technologies（ONT）三代测序的革命性在于无需 PCR 扩增、无需碱基标记的直接测序模式，其核心原理：孔道 - 电流 - 解码

1. 核心组件协同作用：测序芯片上集成数千个工程化生物蛋白孔（如 CsgG 突变体），每个孔道搭配 phi29 DNA 聚合酶或解旋酶，精准控制 DNA/RNA 单链的易位速度，避免因速度过快导致的信号模糊。

2. 电信号检测机制：在电压驱动下，核酸单链穿过纳米孔时，不同碱基（A/T/C/G）及修饰基团（如甲基化）会引起特征性电流阻塞。例如，G 碱基导致的电流降幅与 A 碱基存在显著差异，这些差异信号被高灵敏度放大器捕获。

3. 实时智能解码：通过深度学习算法对原始电流信号进行实时分析，直接转化为碱基序列信息。该过程无需等待测序反应结束，启动后 5 分钟即可输出数据，同时可同步识别 DNA 甲基化、m6A 等表观遗传修饰，实现 “序列 + 修饰” 的同步检测。

从左到右：MinION、GridION、PromethION

ONT 测序流程可分为 “样本预处理 - 文库制备 - 测序运行 - 数据分析” 四大环节，其中前两个环节直接决定测序质量，而 NEB 作为 ONT 官方推荐的试剂供应商，提供了覆盖全流程的专用解决方案：

• 核心需求：基因组测序需 Mb 级超高分子量 DNA，转录组测序需完整 RNA 或全长 cDNA，避免片段化导致的读长损失。

• NEB 配套产品：

• Monarch® 高分子量 DNA 提取试剂盒（货号 T3050/T3060）：针对细胞 / 血液（30 /60min）、组织 / 细菌（90 min）等不同样本，可高效提取 Mb 级 UHMW DNA，片段大小可通过搅拌速率调节，满足不同测序需求。科研用户反馈用更低起始量即可获得高产量，适配长读长测序。

• Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒（T3010）：提取的 DNA 片段长度超 50 kb，纯度lingxian行业同类产品，尤其适合复杂组织样本的全基因组测序。

• NEBNext® 微生物 DNA 富集试剂盒（E2612）：从宿主 DNA 污染的样本中高效富集微生物 DNA，捕获的宿主 DNA 可洗脱保留，无需活细胞培养，适配宏基因组测序。

• 核心需求：修复核酸末端损伤、添加测序接头，提升文库均一性。众多 NEBNext 和 NEB 产品被推荐用于 Oxford Nanopore Technologies 测序平台不同样本类型和不同应用的文库制备流程。

• NEB 配套产品：

• NEBNext® 连接测序配套模块（E7180）：ONT 官方推荐核心产品，整合 FFPE DNA 修复、末端修复 / 加 dA 尾、快速连接，专门为ONT进行了组分优化，杜绝缓冲液过量浪费，适用于 MinION、GridION、Promethion 等所有 ONT 测序仪。

• NEBNext® 连接测序配套模块V2（E7672）：优化版本产品包含经过更新的试剂，以反映牛津纳孔技术众多更新后的SQK-LSK114规程中的变化。

• cDNA 合成解决方案：针对转录组测序，提供 Induro™反转录酶（M0681）、ProtoScript® II 反转录酶（M0368）、LunaScript® 反转录 SuperMix试剂盒（E3010）、NEBNext 单细胞/超低起始量 cDNA 合成 & 扩增模块（E6421），其中 Induro™可在 55℃下 10 分钟合成 12 kb 长片段 cDNA，产量显著高于同类酶，适配直接 RNA 测序或全长 cDNA 测序。

• 全基因组扩增方案：phi29-XT RCA 滚环扩增试剂盒（E1603），含基因工程改造的 phi29-XT 聚合酶，可从 1 fg 环状 DNA 起始扩增，2 小时获得高产量产物，热稳定性和灵敏度优于传统 phi29 酶，支持无细胞 DNA 等低起始量样本的测序。

• 核心流程：将制备好的文库加载到 ONT 测序芯片，启动测序仪后，通过 MinKnow 软件实时监控电流信号，Basecaller 算法将信号转化为碱基序列，后续可通过 Nanopore 社区工具进行组装、变异检测等分析。

• NEB 适配：NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（E7660）专为 ONT 病毒测序优化，采用平衡引物池提升基因组覆盖均一性，所有起始量可共用同一 RT 条件，适用于病毒溯源和变异监测。

• 扩增子测序：LongAmp® 热启动 Taq 2X 预混液（M0533），扩增长度可达 30 kb，保真度为 Taq 酶的 2 倍，适配 16S rRNA 等扩增子测序，兼容 ONT SQK-16S114 试剂盒。

• 甲基化测序：NEBNext® 甲基化建库酶学转化法模块（E7125/E3365），避免重亚硫酸盐转化导致的 DNA 断裂和 GC 偏嗜，5-mC 和 5-hmC 检测灵敏度卓越，适配表观基因组测序。

• 单细胞 / 超低起始量样本：NEBNext® 单细胞 cDNA 合成 & 扩增模块（E6421），单管完成从细胞裂解到 cDNA 扩增的全流程，仅需 2 pg-200 ng 总 RNA，即可制备高质量全长转录本文库。

• 文库加载到 ONT 测序仪后，通过 MinKnow 软件实时监控测序进程，5 分钟内可获得首批序列数据；

• 数据分析可借助 ONT 官方工具或第三方软件，完成基因组组装、变异检测（SNV/SV/CNV）、甲基化位点识别等，NEB 产品制备的文库因均一性高，可显著降低数据分析难度。