技术干货 | 蛋白纯化常见问题汇总(二）

由于样品和杂质的疏水性较难预测，且不同疏水配基具有不同的选择性，建议购买 HiTrap Capto HIC Selection Kit（货号 29321087）或 HiTrap HIC Selection Kit（货号 28411007）筛选最佳填料。需要注意影响填料疏水性的因素包括配基疏水性、配基密度和基架。如果只想先尝试一种，可以从疏水性最强的 Capto Phenyl High Sub（HS）开始尝试，货号 17545108，1 mL 或 17545109，5 mL。

可以将 Protein A 和 Protein G 填料进行 1：1 混合，然后纯化。Cytiva 提供 Protein A 和 Protein G 预混合的重力柱 rProtein A/Protein G GraviTrap，货号 28985256。也可以查询文献作为参考。

普通的 Protein G 和 Protein A 配基，不耐碱，清洗效果差，使用次数很有限。建议反向清洗：

• 对于沉淀或变性的蛋白：用 6M 盐酸胍清洗 2 个柱体积，立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过 10 min。

• 对于去除疏水性的物质（如疏水性蛋白、脂蛋白、脂质）：使用非离子型去污剂，如 0.1% Triton X-100，37 度孵育 1 min。立即用至少 5 个柱体积的无菌结合缓冲液清洗；或者 70% 乙醇浸泡 12 小时左右，然后立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗。注意 70% 乙醇处理时，粘稠故压力大，需要降低流速。

洗脱样品本质上是打破样品分子和亲和配基之间的亲和力，常见的有如下几种方式：

• 改变缓冲液的组成（例如肝素柱Heparin的洗脱方式为高盐洗脱）

• 使用极端pH或者变性剂（例如Protein G的洗脱方式为低pH酸洗）

• 加入目的分子的类似物（例如His标签蛋白的洗脱方式为高浓度咪唑）

• 加入配基的类似物（例如GST标签蛋白的洗脱方式为还原型谷胱甘肽）

避免结合缓冲液中含有螯合剂EDTA或者还原剂或者高浓度咪唑。

检测融合蛋白的His标签是否正确表达；载体设计时增加His标签的长度（例如从6个His变为10个His）或者改变His标签的位置。

适当降低上样时的结合流速，延长标签蛋白和镍柱的孵育时间。

建议增加咪唑浓度或者考虑降低洗脱缓冲液的pH。

如果咪唑浓度已经提高到500 mM，此时再提高咪唑浓度也不会有更好的效果了，可以尝试降低洗脱缓冲液的pH。

值得注意的是缓冲液的pH低于4时，镍柱的配基可能会发生脱落，此时His标签蛋白会和镍一起被洗脱。

如果蛋白始终无法被洗脱，则需要考虑目的蛋白是否在柱上发生了变性沉淀等异常情况。

对于Ni Sepharose FF、HP这两种：

首先需要用20 mM sodium phosphate，500 mM NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4 脱镍；

再按CIP protocols进行清洗（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞）；

脱镍后可以用0.5-1 M NaOH清洗+水洗，再用100 mM NiSO4挂镍；

结束后先水洗，保存在20%乙醇中。

对于Ni Sepharose Excel而言步骤更为简洁，由于无需脱镍可以直接用0.5-1 M NaOH进行清洗+水洗。

Ni Sepharose FF、HP都明确可以耐受8 M尿素或者6 M盐酸胍，而Ni Sepharose Excel 可以耐受6 M盐酸胍，因此可以通过镍柱完成包涵体的变性纯化。

正常情况下镍柱呈现蓝色（如图）。

图：HisTrap HP 镍柱示意图

如果镍柱变白那么大概率是镍配基脱落了，可能是由于样品中含有EDTA导致的，此时建议参考上面的Q7进行CIP操作后补镍，100 mM NiSO4 3-4倍柱体积进行补镍后柱子可恢复为正常的蓝色；

如果镍柱变灰或者发黄（一般出现在镍柱顶端），那么可能是使用过程中出现蛋白沉淀附着在镍柱表面，或者是使用太多次数后仍然没有进行过严苛清洗，同样建议参考Q7的步骤完成CIP；

如果是镍柱变棕色，那么可能是柱子还未脱镍就接触了NaOH，此时建议用较稀的酸尝试清洗，例如pH 4左右的醋酸同时观察清洗效果。

Ni Sepharose FF、HP、Excel这三款填料均可以耐受5 mM DTT以及20 mM β-巯基乙醇，但实际操作过程中会发现平衡缓冲液中添加DTT等还原剂可能导致镍柱变棕色，这是由于DTT等还原剂和镍柱中少量游离的Ni2+形成了棕色络合物。

因此在使用带有还原剂的缓冲液上柱前，建议采用不含还原剂的空白运行（Blank Run）来去除结合较弱或者游离的Ni2+，空白运行包括不含还原剂的平衡缓冲液以及洗脱缓冲液冲洗。

推荐的洗脱缓冲液为50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione，pH 8.0。

需要注意的是，由于还原型谷胱甘肽易被氧化，因此建议洗脱缓冲液每次都是现配现用的，同时建议洗脱缓冲液中加入DTT，溶解还原型谷胱甘肽固体后需要调节pH，将pH提高至8-9可促进洗脱。

如果发现GST标签蛋白洗脱不完全，可以考虑提高还原型谷胱甘肽的浓度至20-40 mM；或者适当增加洗脱缓冲液的量，延长洗脱的时间。