技术干货 | 蛋白纯化常见问题汇总(三）

GST填料无法耐受氢yanghuana，0.5 M氢yanghuana处理可导致填料配基完全失活。

去除蛋白类的残留推荐使用6M盐酸胍，一般使用6M盐酸胍清洗2倍柱体积，接触时间控制在10分钟以内，立即用5倍柱体积的平衡缓冲液进行清洗；去除疏水类杂质的残留，可以使用70%乙醇或者1%Triton X-100冲洗。

MBP（Maltose binding protein）是一种常见的蛋白促溶表达标签，MBP标签通常可以提高目标蛋白的表达水平和溶解度，也可以促进目标蛋白的正确折叠，降低形成包涵体的风险【1】。MBP蛋白的分子量约42.5 kDa，一般需要在纯化后进行酶切去除MBP标签。特别需要一提的是，MBP标签去除后一定要持续关注目的蛋白的稳定性。

不同样品的实际载量需要进行测试。动态结合载量（Dynamic Binding Capacity，DBC）是在实际样品操作条件下的结合能力。

对于亲和层析，DBC依赖于缓冲液的pH、离子强度、添加剂以及样品本身的性质。

另外，流速也会影响动态结合载量，一般来说，流速越低，动态结合载量越高，如果流速接近于零，动态结合载量等于静态结合载量。

层析填料的DBC是在给定流速条件下发生未结合蛋白显著穿透之前结合的目标蛋白量，通过绘制蛋白上样量与穿透百分比的曲线生成穿透曲线。DBC可在穿透曲线上测定，例如10%蛋白流穿时称为QB10值，请点击文末“阅读原文”查看具体内容。

样品粘度增加对于分离度的影响很小，但可能会导致色谱柱上的背压增加。

对于高粘度溶液和/或低温溶液，请使用较低的运行流速。当运行高粘性样品（例如含有甘油的样品）时，如果在上样期间背压增加，则可能需要稀释样品或降低流速。粘度随温度而变化。如果样品与所用缓冲液的粘度相差不超过1.5倍，通常不会影响分离。

如果样品的粘度非常高，则可以通过增加洗脱液的粘度来补偿，例如添加蔗糖或葡聚糖。

另请注意，液体的粘度随着盐浓度的增加而增加。混合有机溶液也会影响粘度，例如50%乙醇溶液的粘度远高于纯水和100%乙醇。具体的推荐流速可参考各产品说明书。

MBP（Maltose binding protein）是一种常见的蛋白促溶表达标签，MBP标签通常可以提高目标蛋白的表达水平和溶解度，也可以促进目标蛋白的正确折叠，降低形成包涵体的风险【1】。MBP蛋白的分子量约42.5 kDa，一般需要在纯化后进行酶切去除MBP标签。特别需要一提的是，MBP标签去除后一定要持续关注目的蛋白的稳定性。

定期清洁层析柱（例如每运行3-5次后）将延长其寿命，并有助于实现层析柱的最佳性能。

清洁可去除可能积聚在色谱柱上的任何沉淀蛋白质或其他污染物。除了常规清洁外，如果您在柱床顶部看到变色或背压大幅增加，您也应该清洗层析柱。

SEC层析柱对高pH具有良好的耐受，可以用NaOH多次清洗。NaOH的浓度取决于填料类型：Superose和Superdex色谱柱使用0.5 M NaOH，而Sephacryl层析柱仅使用0.2 M NaOH。

不建议清洁用于脱盐/缓冲液置换且含有Sephadex的一次性产品。切勿将层析柱存储在NaOH中。相反，清洗后立即用两倍柱体积（CV）的水冲洗层析柱，然后用两倍柱体积的运行缓冲液平衡层析柱。详细的清洁方案可参考各产品的说明书。

当您超过2天不使用层析柱时，请将其储存在20%乙醇中。

此外，为防止空气进入色谱柱，请将shipping device（红色柱顶端上方连接的形似“针筒“的小装置）连接到色谱柱出口。

Cytiva的Superdex Increase和Superose Increase层析柱可以使用标准的1/16接头接入传统HPLC系统，用于分析目的，例如质量控制。

初次使用建议先以较低的流速运行，防止超压，后续可根据层析柱的压力情况调整运行流速。

凝胶过滤层析柱主要有三类，分别是制备型、分析型、组分分离型。

制备型的凝胶过滤层析柱使用长柱（通常为60 cm 或更长）并以低流速运行，上样量为柱体积的0.5%-4%，填料粒径通常>12 μm，层析柱运行时背压很低。

分析型的凝胶过滤层析柱用于检测样品的质量或研究生物分子的性质，上样量非常少，通常为柱体积的0.3%-0.5%，使用长柱（通常为30 cm）并以低流速运行。

填料粒径通常为4-12 μm，要求层析柱分辨率较高，预装柱（供应商已经将层析填料高质量的装填到层析柱中，无需客户自行装填，到手即可使用）是确保可靠结果和便利性的juejia选择。

另外分析型凝胶过滤层析柱也可用于样品纯度的快速检查和筛选。通常选用柱高为15 cm的高分辨率柱，循环时间短，上样量小，buffer消耗低。Cytiva的Increase 5/150系列，几分钟就可以完成一次循环。

组分分离型一般是将小分子（如盐或游离标记物）与一组较大的分子（如蛋白质）分离，因此对于层析柱的分辨率要求较低。

主要用来做样品脱盐和缓冲液置换，上样量较大可达柱体积的30%，使用宽而短的层析柱并以高流速运行。填料粒径相对较大，背压较低。

首先判断超压报警是由什么原因引起的，先把柱子by-pass或者柱子不接入系统，看下系统的运行压力。判断到底是层析系统还是层析柱引起的超压。

一旦确认是层析柱的问题，先检查下层析柱顶端柱床是否出现塌陷，如果出现塌陷请向下调节柱头压紧胶面。

然后请尝试反向冲洗层析柱，如果压力依然很高，建议更换层析柱内的滤膜，滤膜属于消耗品，一旦滤膜出现变色（变绿，变棕黄，变黑），也请及时进行更换。

层析柱清洁不到位，或者样品浊度粘度过高，经常会引起滤膜堵塞导致层析柱超压。